No genoma humano existem sequências de DNA repetitivas que são reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas de restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.
Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese (técnica em que determinadas moléculas são sujeitas à acção de um campo eléctrico num meio poroso) e o resultado é um padrão de bandas que difere de indivíduo para indivíduo.
( http://biohelp.blogs.sapo.pt/2575.html )
As principais aplicações da técnica do DNA fingerprinting são as seguintes:
- Genética forense – A dactiloscopia genética é uma técnica utilizada na ciência forense onde se analisam as diferenças entre os DNA minissatélites, já referidos, provenientes de material biológico deixado num local (sangue, cabelo, esperma…). Estes segmentos encontram-se entre os genes. A hipótese de dois indivíduos sem qualquer relação de parentesco possuírem exactamente os mesmos minissatélites é muito remota, por isso a dactiloscopia do DNA constitui um teste viável. A região minissatélite é cortada em fragmentos por enzimas de restrição que são separados através de electroforese. É produzido um padrão de bandas de DNA. Os padrões de indivíduos diferentes podem ser comparados e as diferenças são facilmente detectadas e as pessoas distinguidas. Isto permite a identificação de cadáveres e a identificação de criminosos. Contudo, na análise dos suspeitos de um crime, por exemplo, é de ter em conta se estes têm irmãos gémeos, uma vez que, através das impressões digitais genéticas, não se podem distinguir dois gémeos monozigóticos, pois os padrões de banda são os mesmos.
- Determinação de paternidade – Como cada indivíduo herda a disposição dos seus nucleótidos dos seus pais, comparando os padrões de banda de um indivíduo com os dos alegados progenitores, podem-se obter probabilidades de parentesco que nos levem a excluir a paternidade ou a confirmá-la com um elevado grau de certeza. Se os dois padrões forem suficientemente semelhantes (tendo em conta que só metade do DNA é herdado de cada progenitor), então a paternidade confirma-se.
- Se utilizada em conjunto com metodologias sociológicas, a técnica das impressões digitais genéticas pode ser usada para analisar padrões de migração e confirmar origens de étnicas.
- Esta tecnologia pode ser usada para prever a nossa saúde futura. Assim, pode ser utilizada para localizar os genes de doenças hereditárias. Se um padrão particular de DNA aparece repetidamente em diferentes doentes, os cientistas podem verificar qual(is) o(s) gene(s), ou pelo menos qual(is) pedaço(s) de DNA, que poderá(ão) estar envolvido(s). Como o conhecimento dos genes envolvidos na susceptibilidade a uma doença dá pistas sobre fisiologia subjacente à doença, o DNA fingerprinting auxilia no desenvolvimento de terapias. Pode também ser usado no período pré-natal para detectar possíveis anomalias hereditárias, como a distrofia muscular ou a doença de Huntington, de forma a que possa ser disponibilizado aconselhamento médico e possam ser adoptadas as devidas precauções.
( http://www.biologia-ap.no.comunidades.net/index.php?pagina=1288163696 )
PCR
PCR é uma técnica que permite amplificar qualquer porção de DNA fora das células.
Material necessário para a técnica de PCR:
- sequências de DNA que se pretende amplificar;
- um par de iniciadores (primers);
- os quatro tipos de nucleótidos;
- uma polimerase DNA (Taq);
- solução-tampão que impeça variações de pH e que contenha Mg² , ião essencial para a actividade da polimerase.
A reacção de PCR corresponde a um conjunto de ciclos, englobando cada um destes ciclos:
- Desnaturação da dupla hélice: é conseguida com a incubação do DNA a uma temperatura de 95°C, formando duas cadeias simples a partir de uma dupla cadeia;
- Emparelhamento dos iniciadores: diminuição da temperatura aproximadamente para os 55°C, para ocorrer a ligação dos primers;
- Polimerização de DNA: ocorre a 70°C, temperatura óptima de actividade da Taq polimerase. Esta liga-se na região dos iniciadores, e promove a polimerização, com elongação da cadeia de DNA, servindo a outra como molde.
Este ciclo é repetido dezenas de vezes, para obter milhões de cópias de DNA, em poucas horas e sem intervenção manual. No final, leva à produção de 2^n moléculas de DNA de interesse, em que n representa o número de ciclos.
A taq polimerase é uma polimerase extraída da Thermus aquaticus, uma bactéria que habita fontes termais com água extremamente quente, resistindo às variações de temperatura e contribuindo significativamente para o sucesso da técnica de PCR (o aquecimento para desnaturar as cadeias de DNA provocava a inactivação definitiva da polimerase, obrigando a adicionar mais enzima por ciclo de aquecimento).
Um dos aspectos mais negativos desta técnica é a grande sensibilidade ``a contaminação com DNA estranho, podendo ocorrer emparelhamento entre os iniciadores e este DNA estranho, amplificando sequências não pretendidas.
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A utilização da técnica de PCR serve essencialmente para a obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo, a partir de uma quantidade muito pequena. Esse DNA pode ser posteriormente utilizado em técnicas de recombinação de DNA ou em fingerprint.
TÉCNICA DO DNA COMPLEMENTAR (cDNA)
O DNA complementar (cDNA) é um outro processo através do qual se podem conseguir bibliotecas de genes e é utilizado, na maior parte das vezes, como um auxiliar da técnica do DNA recombinante. O cDNA é obtido a partir do mRNA maturado (que já sofreu processamento e que, portanto, não possui intrões) por complementaridade de bases. Esta transcrição em sentido inverso é conseguida através da acção da enzima viral denominada transcriptase reversa. Assim, o mRNA funciona como molde para a síntese de uma cadeia de DNA. Após a formação da cadeia de DNA, a enzima DNA polimerase actua, formando, por complementaridade, a outra cadeia de DNA a partir dos nucleótidos presentes no meio, constituindo-se uma molécula estável.
( Silva_etal 2009 )
A aplicação do DNA complementar pode ser utilizada na obtenção de cópias de genes que codificam produtos com interesse, que torna possível a produção de proteínas humanas por procariontes que podem ser cultivados facilmente em biorreactores.
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINATE (rDNA)
A tecnologia do DNA recombinante, permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes, dando origem a uma molécula de DNA recombinante (DNAr).
Esta tecnologia baseia-se na utilização de ferramentas moleculares como as enzimas de restrição, as ligases do DNA e os vectores.
As enzimas de restrição reconhecem determinadas sequências de DNA e cortam a molécula nesses locais. As zonas de restrição correspondem a sequências de DNA curtas e simétricas que se lêem da mesma forma nas duas cadeias na direcção 5'-3'. Os fragmentos obtidos são então incorporados num vector, isto é, numa molécula capaz de transportar o fragmento de DNA para uma célula. Os bacteriófagos e os plasmídeos são dois exemplos de vectores utilizados na tecnologia do DNA recombinante.
Para que o fragmento de DNA estranho seja incorporado no vector, é necessário que a mesma enzima de restrição que actuo sobre esse DNA actue sobre o vector, de forma a expor uma sequência nucleótida complementar. Os dois segmentos de DNA ligados por acção da enzima DNA ligase produzindo uma nova molécula estável - DNA recombinante.
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( Silva_etal 2009 )
Inserção de DNA estranho num Plasmídeo
Processo de obtenção e expressão de uma molécula de DNAr:
1 - Selecciona-se uma molécula de DNA dadora, contendo o gene com interesse que se pretende transferir e clonar, e um vector adequado.
2 -A molécula de DNA e o vector são tratados com a mesma enzima de restrição, que corta as duas moléculas em regiões com a mesma sequência de nucleótidos.
3 - Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vector e juntam-se ligases do DNA. O vector e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivas, que são complementares, e a ligase estabelece a ligação.
4 - O vector, contendo o DNA dador, é transferido para uma célula ou organismo receptor.
5 - O DNA dador é incorporado no genoma da célula ou organismo receptor, que passa a possuir um DNA recombinante.
6 - Um meio selectivo ou testes químicos permitem identificar as células que exprimem o gene desejado. No processo descrito formam-se fragmentos de restrição que não têm o gene desejado e nem todas as células receptoras incorporam o DNA dador.
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http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/recombinante.php
As aplicações do DNA recombinante:
- Processos de cicstrização de feridas
- Cancro
- Hemofilia
- Hepatite B
- Despiste da SIDA
- Anemia
- Insulina
SÍNDROMES
Síndrome de Down
· Trissomia 21 (47, XX + 21 ou 47,XY + 21)
· É a aneuploidia mais viável no Homem.
· Indivíduos de baixa estatura com uma morfologia das pálpebras característica, boca pequena e atraso mental em grau variável.
http://www.corneliodigital.com/imagens/belsaude/sindrome_de_down.jpg
Síndrome de Edwards
· Trissomia 18
· Atraso mental grave, malformações cardíacas e morfológicas. Raramente sobrevivem mais do que alguns meses.
www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/sindrome-de-edward/imagens/sindrome-de-edward-2.jpg
Síndrome de Patau
· Trissomia 13
· Malformações morfológicas e do sistema nervoso central graves. Atraso mental profundo. Raramente sobrevivem mais do que alguns meses.
Síndrome de Turner
· Monossomia X (45,X0), outros.
· Infantilismo sexual (formação de ovários vestigiais),baixa estatura, pregas perigonucais, inteligência, geralmente, normal.
· A maioria dos sintomas são mais notórios na puberdade, pelo que nesta idade, se as doentes não forem submetidas a um tratamento hormonal, não desenvolverão os caracteres sexuais secundários.
Trissomia do X
· 47,XXX
· Mulheres com estatura normalmente acima da média, frequentemente estéreis e com inteligência acima do normal.
Síndrome de Klinefelter
· 47,XXY
· Estatura grande, testículos e pénis pequenos, reduzida pilosidade púbica e seios salientes.
2.bp.blogspot.com/_tIgNztGuUz0/SdyedsfN73I/AAAAAAAAAJM/TiYUpANguRQ/s320/Klinefelter.jpg
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